Aurélie 13/03/12
 

 

   Analyse de conservateurs par HPLC : concours Assistant en techniques d'analye chimique Reims 2011.



 

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Généralités sur la chromatographie.
Rappelez le principe de toute méthode chromatographique.

La chromatographie est une méthode de séparation et d'identification des constituants d'un mélange.
La chromatographie est basée sur la différence de solubilité d'une substance dans deux phases non miscibles:la phase stationnaire liée au support et la phase mobile ou solvant.
Plus une substance est soluble dans la phase mobile, plus elle est entraînée par cette phase; inversement, une substance peu soluble dans la phase mobile migre peu.

Un fluide appelé phase mobile parcourt un tube appelé colonne. Cette colonne peut contenir des "granulés" poreux (colonne remplie) ou être recouverte à l'intérieur d'un film mince (colonne capillaire). Dans les deux cas, la colonne est appelée phase stationnaire.

A l'instant initial, le mélange à séparer est injecté à l'entrée de la colonne où il se dilue dans la phase mobile qui l'entraîne à travers la colonne. Si la phase stationnaire a été bien choisie, les constituants du mélange, appelés généralement les solutés, sont inégalement retenus lors de la traversée de la colonne.
 
De ce phénomène appelé rétention il résulte que les constituants du mélange injecté se déplacent tous moins vite que la phase mobile et que leurs vitesses de déplacement sont différentes. Ils sont ainsi élués de la colonne les uns après les autres et donc séparés.
Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un enregistreur permet d'obtenir un tracé appelé chromatogramme. En effet, il dirige sur un enregistreur un signal constant appelé ligne de base en présence du fluide porteur seul ; au passage de chaque soluté séparé il conduit dans le temps à l'enregistrement d'un pic.

Dans des conditions chromatographiques données, le "temps de rétention" (temps au bout duquel un composé est élué de la colonne et détecté), caractérise qualitativement une substance. L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limitée par ces pics et la prolongation de la ligne de base permet de mesurer la concentration de chaque soluté dans le mélange injecté.
C'est en jouant sur la nature de l'éluant (et dans une moindre mesure sur la nature du support) que l'on parvient à séparer les constituants d'un mélange.
Quels sont les phénomènes mis en jeu dans le cas d’une chromatographie d’adsorption ? De partage ?

La chromatographie de partage
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Elle est basée sur la différence de solubilité du soluté dans la phase mobile et la phase stationnaire
C'est une chromatographie liquide-liquide. La phase stationnaire est un liquide fixé sur un support inerte. Cette chromatographie est ainsi dénommée car elle est basée sur le partage du soluté dans les deux phases liquides (  Chromatographie d'adsorption :
C'est une chromatographie liquide-solide. La phase stationnaire est un adsorbant solide polaire.
- La chromatographie d'adsorption en phase inverse :
C'est une chromatographie liquide-solide dans laquelle la phase stationnaire est apolaire.

Citez un exemple de phase stationnaire utilisée en chromatographie d’adsorption et en chromatographie de partage.

 La phase stationnaire est un solide à grand pouvoir d'adsorption : oxyde d'aluminium, les silicates de magnésium, les gels de silice.
Chromatographie de partage liquide liquide : la phase stationnaire est très fine couche de liquide adsorbé sur un solide inerte. Groupements silanols polaires ( phase normale ) ou  greffons akyles  apolaires ayant de 8 à 18 atomes de carbone ( phase inverse ). 
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Analyse de conservateurs présents dans un produit cosmétique.
On cherche à analyser par chromatographie en phase liquide ou HPLC trois conservateurs :
- l’acide para-hydroxybenzoïque ; - le para-hydroxybenzoate de méthyle - le para-hydroxybenzoate d’éthyle.
Les conditions d’analyse retenues sont les suivantes :
- colonne C18, 4x125 mm ; - éluant : mélange 70% A et 30% B avec : - A = H2O, 0.1 % d’acide trifluoroacétique B = acétonitrile,
- débit phase mobile 1 mL/min ; - détecteur UV-visible 254 nm - boucle d’injection 10 mL.

Donnez les formules semi-développées de ces trois composés.

Donnez les formes mésomères de l’acide para-hydroxybenzoïque.

Que signifie le terme C18 de la phase stationnaire ?
les groupes alkyles greffés sur la phase stationnaire comptent 18 atomes de carbone.

Quel est le rôle de l’acide présent dans la phase mobile ?
En milieu basique, le phénol se trouverait sous la forme d'ion phénolate, l'acide carboxilique serait en partie sous forme d'ion carboxylate et les esters pourraient être en partie saponifiés.
Le milieu acide évite ces réactions.



Prévoir en le justifiant l’ordre d’élution de ces composés. Quel type d’interaction assure leur séparation ?
La phase stationnaire est apolaire ; la phase mobile est polaire : les espèces les plus polaires migrent le plus vite.
Dans l'ordre, du plus rapide au moins rapide : acide parahydroxybenzoïque, parahydroxybenzoate de méthyle, parahydroxybenzoate d'éthyle.
Interaction électrostatique dipôle dipole, liaisons hydrogène.
Les temps de rétention obtenus sont trop longs : comment modifier l’éluant pour diminuer ces temps de rétention ?
Modifier la polarité de l'éluant.
HPLC : élution graduée : sur une colonne apolaire, en utilisant une phase mobile eau/méthanol, les composants les plus hydrophobes sont élués avec une concentration élevée en méthanol alors que les composants plus hydrophiles sont élués préférentiellement avec une concentration faible en méthanol.
Vous souhaitez dans les conditions décrites précédemment quantifier ces trois conservateurs dans un shampooing :
– en quoi les conditions chromatographiques décrites permettent-elles d’envisager d’effectuer un étalonnage externe ?
On injecte successivement un  volume V constant d’une solution étalon (concentration en élément à doser connue Cref) et la solution à doser (concentration inconnue Ci). Comparer les chromatogrammes pour en déduire la concentration.
Créf = k Aréf ; Ci = k Ai ; Ci =Créf  Ai / Aréf  avec A : aire du pic.
Le spectre IR du para-hydroxybenzoate de méthyle est représenté ci-dessous ; retrouvez les bandes caractéristiques de cette molécule.

Pourquoi la bande à environ 3400 cm-1 est-elle large ?
Groupe O-H ( phénol) associassions par liaison hydrogène.
Le spectre RMN 1H du para-hydroxybenzoate de méthyle est représenté ci-dessous, l’intégration est précisée en dessous de chaque signal.
Attribuez les différents signaux, en précisant pour chacun d’eux le déplacement chimique, la multiplicité et l’intégration.

1 : trois protons, d = 3,9 ppm, aucun proche voisin, donc singulet.
2 : 1 proton, d = 6,67 ppm, aucun proche voisin, donc singulet.
3 : deux protons, d = 6,9 ppm, un proche voisin, donc doublet.
4 : deux protons, d = 7,9 ppm, un proche voisin, donc doublet.






On réalise une analyse par spectrométrie de masse (impact électronique) du parahydroxybenzoate de méthyle. Le spectre obtenu est représenté ci-dessous.

Que signifie le rapport m/z ? Rapport masse sur charge.
Quel est le pic moléculaire ? Pic à m/z =152.
Quel est le pic le plus abondant ? Proposez une structure pour ce fragment.
Pic à m/z = 121.








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